И.И. Моргулис, Р.Г. Хлебопрос

Красноярский научный центр СО РАН
Сибирский федеральный университет
(Россия, Красноярск)

Живые организмы любой сложности вынуждены жить в условиях, предлагаемых им той средой, которая их окружает. В этом взаимодействии складывается набор ответных реакций организма, всегда очень сложный, тем более сложный, чем сложнее сам организм, чем более продвинутым эволюционно он является. У высокоразвитых животных с их специально выработанным для сохранения целостности собственного организма в постоянно изменяющейся внешней среде приспособлением, которое Уолтер Кеннон назвал гомеостазом, эта реакция сложна, разветвлённа и многоступенчата.

Любое экологическое воздействие (извне) вызывает цепь последовательных адаптивных реакций, реализующихся, пока гомеостатические механизмы не разрушены, в тесной пространственной (в пределах этого организма) и временной взаимосвязи. Концентрации веществ, даже жизненно необходимых для функционирования организма, имеют свои гомеостатические пределы, выход за рамки которых, будь то избыток или недостаток, приводит к комплексу локальных и системных реакций, направленных на устранение результатов этого выхода.

Одним из экологически значимых для организма химических факторов является элемент № 27 Периодической системы Д.И. Менделеева – кобальт. Кобальт относится к группе микроэлементов, т.е. является жизненно необходимым для функционирования живых организмов. Вместе с тем, в избытке, как и многие другие элементы или более сложные вещества, он для организма токсичен и даже может быть губителен.

Микроэлементы и живые организмы. Роль кобальта

Микроэлементами в отечественной литературе (а в англоязычной – следовыми элементами, trace elements) называется группа химических элементов, содержащихся в организме животных и человека в очень малых количествах (10-3(10-12 %). Исследование биологической роли микроэлементов в нашей стране ведет свое начало от работ В.И. Вернадского [1, 2]. Среди литературы на английском языке особое место занимают работы Эрика Андервуда, автора и редактора неоднократно издававшегося руководства «Микроэлементы в питании животных и человека » [3]. В обширном перечне литературы по биологической роли микроэлементов на русском языке основополагающими являются работы А.И. Войнара [4], В.В. Ковальского [5 – 7], А.П. Авцына и сотр. [8, 9]. По мнению авторов работы [9], «микроэлементы ( это скорее всего не случайные ингредиенты тканей и жидкостей живых организмов, а компоненты закономерно существующей очень древней и сложной физиологической системы, участвующей в регулировании жизненных функций организмов на всех стадиях развития» (с. 13). Основными принципами функционирования этой физиологической системы являются: «...1) избирательное поглощение определенных микроэлементов; 2) избирательная концентрация их в определенных организмах, органах, тканях и некоторых органеллах клетки и 3) их селективная элиминация» [9, с.13]. Одним из существенных для функционирования живых организмов микроэлементов является представитель VIII группы периодической системы элементов Д.И. Менделеева кобальт.

Особенности химии кобальта и его соединений

Кобальт является типичным d-элементом, т.е. одним из так называемых главных переходных элементов, атомы которых характеризуются внутренней застройкой d-подоболочек. Так как s-орбиталь внешней электронной оболочки в соответствии с правилами заполнения уже имеет 2 электрона, каждый «новый» электрон, добавляемый в электронную оболочку очередного d-элемента, попадает не на внешнюю оболочку, а на предшествующую ей внутреннюю подоболочку. Химические свойства таких элементов обусловлены участием в реакциях электронов обеих оболочек. Электронная конфигурация кобальта с атомным номером 27 такова: 1s²2s²2p⁶3s²3p⁶3d⁷4s². В соединениях кобальт проявляет две степени окисления: +2 (в большинстве простых соединений) и +3 (в основном, в комплексах). Характерными химическими свойствами d-элементов и их соединений являются: образование соединений внедрения, переменные состояния окисления, парамагнетизм, способность к образованию комплексных ионов, образование окрашенных соединений, каталитичекая активность. Важнейшими из свойств переходных элементов, обусловливающими их уникальные биологические возможности, являются способность к комплексообразованию и способность к участию в окислительно-восстановительных реакциях. Атомный радиус кобальта 0.125 нм, радиус иона Co²⁺ – 0.82 Å. Эти величины близки к соответствующим для таких металлов, как железо (0.124 нм и 0.83 Å, соответственно), цинк (0.133 нм и 0.82 Å, соответственно), немного меньше, чем для кальция (0.197 нм и 0.99 Å, соответственно). Помимо собственных биологических эффектов, которые и представляют собой предмет исследования в данной работе, кобальт способен, в силу сходства с упомянутыми металлами, биологическую роль которых трудно переоценить, имитировать или модифицировать их действие [10 – 13].

Биологическая функция кобальта

Существуют определенные диапазоны концентраций, в которых микроэлементы, в том числе металлы и, в частности, кобальт, необходимы живым организмам [9, 14]. Избыток этих элементов для организма вреден, тогда как присутствие металлов, не имеющих биологической функции, вредно всегда (рисунок 1, цит. по [14]).

Рисунок 1. Токсичность металлов. Кривая 1 характерна для микроэлементов, кривая 2 – для металлов, не имеющих биологической функции (цит. по [14]).

Наши представления о физиологическом эффекте микроэлементов, в частности кобальта, представлены на рисунке 2.

Рисунок 2. Физиологический эффект микроэлементов

Дело в том, что вреден не только избыток, но и недостаток микроэлементов. Благотворный эффект начинается не просто с присутствия микроэлемента в организме, а начиная с некоторых концентраций, отвечающих потребности в нем данного организма (рисунок 2). Таким образом, «кривая полезности» микроэлемента имеет четко различающиеся три части: левая, находящаяся по эффекту (ось ординат) в отрицательной области, средняя, с положительным эффектом, после достижения некоторой пороговой концентрации С₁ и правая, с вредным эффектом избытка элемента, начиная с некоторого порогового значения С₂.

Серьезный интерес к биохимии кобальта возник около 1934 г. в связи с тяжелыми заболеваниями крупного рогатого скота и овец в самых разных уголках мира (Россия, Шотландия, Австралия, Новая Зеландия, Канада). Животные теряли массу, аппетит, становились вялыми, анемичными и в конце концов погибали. Наличие анемии наводило на мысль о причастности к этому дефицита железа. Но оказалось, что дело не в самом железе, а в присутствии в соединениях железа очень малых количеств кобальта. Добавление к корму кобальта полностью снимало все токсические симптомы [14, 15].

Кобальт как микроэлемент необходим всем живым организмам. Существует много работ, касающихся роли кобальта в физиологии растений: растения накапливают кобальт (главным образом в корнях), его содержание повышается в период роста и снижается во время цветения. Небольшие добавки кобальта приводят к значительному повышению урожая и улучшению его качества (злаки, картофель, бобовые). К пищевым продуктам с высоким содержанием кобальта относятся: свекла (особенно ботва), хлеб, гречиха, капуста, инжир, зеленый лук, грибы, груши, редис, помидоры. Кобальта в них содержится около 0.2 мг/кг. Яблоки, абрикосы, бананы, морковь, вишня, кофе, кукуруза, баклажаны, овес, перец, картофель, рис, злаки (&asymp0.05 мг/кг) [15].

Данные по содержанию кобальта в крови и различных органах животных и человека приводятся в очень многих работах. Приведем лишь некоторые из них. В крови человека содержание кобальта составляет в среднем 0.238 мг/кг, при этом в эритроцитах оно варьирует от 0.059 до 0.13, а в сыворотке – от 0.0055 до 0.40 мг/кг. В органах животных наибольшая концентрация кобальта приходится на печень (0.076 – 0.201 мг/кг), затем идут почки, поджелудочная железа, селезенка. Выводится кобальт из организма животных и человека в основном почками. Среднее поступление кобальта в организм человека с пищей около 0.03 – 0.3 мг в день, достаточно для нормального метаболизма низшей дозы – 0.03 мг [15 – 17].

Основной биологической ролью этого элемента считается его присутствие в молекуле витамина В₁₂, в которой его массовая доля составляет 4%. У человека и животных он является коферментом ряда жизненно важных ферментов – рибонуклеозидтрифосфатредуктазы (КФ 1.4.3.8), метилтрансферазы (КФ 2.1.1.13), метилмалонил-СоА-мутазы (КФ 5.4.99.2). Недостаток витамина В12 приводит к злокачественной (пернициозной) анемии у человека. Эти сведения давно вошли в учебники по физиологии и биохимии.

Значительно менее известно то, что в составе активного центра ряда ферментов содержится кобальт, не входящий в В₁₂. Это метилмалонил-СоА-карбоксилтрансфераза (КФ 2.1.3.1), пропионил-СоА-карбоксилаза (КФ 6.4.1.3). Кобальт может выступать в качестве кофермента также в составе некоторых пирофосфатаз, пептидаз, аргиназы [9, 13]. Есть сведения о том, что кобальт может влиять на активность ферментов, в частности, аденилатциклазы и ряда других [16, 18]. Особое влияние он оказывает на ферменты метаболизма гема [19].

Физиологические и патофизиологические эффекты кобальта разнообразны. Есть сведения о влиянии его на метаболизм углеводов и липидов [20, 21], на функцию щитовидной железы [9, 22], состояние миокарда [9, 17]. Именно т.н. «пивная кардиомиопатия» привлекла внимание к токсическим влияниям кобальта, что привело к прекращению его использования для лечения анемий. Дело в том, что в некоторых странах в течение ряда лет (60-е гг. ХХ столетия) для улучшения пенообразования к пиву добавляли кобальт (1.2 – 1.5 мг/л), и это повлекло тяжелые заболевания вплоть до летальных исходов у любителей этого напитка. Кобальт может способствовать развитию опухолей [23 – 26], он даже внесен в перечень канцерогенных агентов IARC (Агентства по исследованию рака Международной Организации Здравоохранения) [26], в то же время его комплексные соединения оказывают противоопухолевое действие [27]. Он токсичен [28 – 31] (первые сведения о токсичности кобальта появились еще в 1883 г. [32]), в то же время и сам может выступать как противоядие при интоксикации цианидами [33]. Есть сведения об эпилептогенном действии кобальта [34]. Достаточно большой ряд старых работ, начиная от [31], свидетельствуют о влиянии кобальта на артериальное давление и тонус сосудов. Данные разноречивы: наблюдали как вазодилатационный, так и вазоконстрикционный эффекты, как снижение, так и повышение давления. Больше свидетельств вазодилатационного влияния, хотя мы в своих (неопубликованных) экспериментах по искусственному жизнеобеспечению изолированной почки крысы наблюдали резкую вазоконстрикцию при добавлении хлористого кобальта в циркулирующий перфузат.

Кобальт широко используется в металлургии, являясь составной частью сплавов тяжелых металлов, используется при шлифовке алмазов, в производстве осушающих агентов, пигментов и катализаторов [35]. Радиоактивные изотопы кобальта используются в промышленности, медицине, ядерных исследованиях. В воздухе рабочей зоны при производстве порошкообразного кобальта его концентрация составляет от 0.675 до 10 мг/ м³ [36], а при производстве сплавов тяжелых металлов – от 14.6 до 37.4 мг/м³ [37]. Профессиональные заболевания у персонала таких производств – это пневмонии, фиброзы и астма [17]. В эксперименте на крысах однократная 30-минутная экспозиция животных в среде с кобальт-содержащим аэрозолем (26 – 236 мг/ м³) приводила к возникновению застойных явлений в легких, отеку и кровоизлияниям [38].

Несмотря на то, что токсическое действие кобальта доказано многократно, молекулярные механизмы его токсичности до конца не идентифицированы. Кобальт генотоксичен [39, 40], кобальт индуцирует окислительный стресс [41], апоптоз [42] и, наконец, кобальт имитирует в клетке состояние гипоксии [43], что затем приводит к активации апоптоза, гликолиза, ангиогенеза и эритропоэза. В основе очень многих проявлений влияния кобальта на функции живых организмов лежит один универсальный внутриклеточный механизм – активация так называемого индуцируемого гипоксией фактора, или HIF (hypoxia inducible factor) [43]. Механизм этот – не единственный. Недавно в эксперименте на культуре легочных клеток человека были идентифицированы 85 генов, экспрессия которых в ответ на воздействие кобальта в высоких дозах изменяется [44]. Среди белков, кодируемых этими генами, присутствуют белки-переносчики кобальта, суппрессоры и транскрипционные факторы опухолей, белки, вырабатываемые в ответ на стресс. Из 85 идентифицированных авторами белков лишь 7 было связано с HIF. Таким образом, эффекты повышенных доз кобальта на организм не исчерпываются имитацией гипоксии. Тем не менее, в контексте настоящей работы связь кобальта и гипоксии следует рассмотреть подробнее.

Кобальт и гипоксия

Вредное воздействие кобальта в высоких концентрациях связывают главным образом и в первую очередь с тем, что избыточное поступление кобальта в организм сопровождается состоянием гипоксии или «ощущением» клеткой нехватки кислорода. А для нормального функционирования всех клеток любого организма кислород необходим. У простых беспозвоночных, состоящих из нескольких слоев клеток, для оксигенации достаточна простая диффузия кислорода непосредственно из окружающей среды. Например, у имаго Drosophila melanogaster система разветвленных трахеальных трубок доставляет воздух во все уголки тела, позволяя кислороду свободно диффундировать в отдельные клетки. Гораздо большие размеры тела у человека и других позвоночных привели к развитию сложной физиологической инфраструктуры, на базе которой развились и возможности для гибкой, достаточно быстрой и соответствующей потребности доставки кислорода клеткам в нормальных и отличающихся от нормы условиях.

Адекватная доставка кислорода клеткам очень важна для всех аэробных организмов по двум причинам: потому что он служит терминальным акцептором электронов при окислительном фосфорилировании и потому что в ряде ферментативных процессов молекулярный кислород выступает в роли субстрата. Механизмы чувствительности клеток к недостатку кислорода исследуются достаточно давно, поиски «кислородного сенсора» ведутся достаточно интенсивно. И только в последние несколько лет усилиями нескольких исследовательских групп были выяснены, с одной стороны, тонкие и сложные, а с другой – универсальные молекулярные и клеточные механизмы реакции клеток в организме на нехватку кислорода и определены кандидаты на роль «сенсора».

Первоначально исследовались механизмы влияния гипоксии на продукцию эритропоэтина, специфического фактора роста эритроидных клеток. Хорошо известно, что основными органами, продуцирующими в организме взрослого млекопитающего этот фактор, являются печень и почка. Удобной моделью для исследования закономерностей индукции гипоксией экспрессии гена эритропоэтина in vitro оказались культуры клеток гепатобластомы человека Hep3B и НерG2 [45]. Результаты исследований на этих линиях клеток позволили выдвинуть гипотезу т.н. «гемопротеинового сенсора кислорода» [46, 47]. Согласно представлениям авторов гипотезы, роль кислородного сенсора в клетках (в данном случае клетках гепатобластомы) играет молекула гемопротеина, конформация которой зависит от напряжения кислорода в среде, в которой находятся эритропоэтин-продуцирующие клетки. Если напряжение кислорода низко, гемопротеин переходит в дезокси-конформацию и тем самым запускает цепь молекулярных событий, в конце концов приводящих к экспрессии гена эритропоэтина. В условиях достаточно высокого напряжения кислорода молекула гемопротеина находится в неактивной окси-конформации и на стимулирует продукцию эритропоэтина. Существенным оказалось то, что хлорид кобальта, известный стимулятор эритропоэза вообще и продукции эритропоэтина в частности (а также, хотя и в меньшей степени, хлористые соли других переходных металлов, никеля и марганца) в рамках этой гипотезы действует через сходные механизмы: атом кобальта вытесняет атом железа из гема сенсорной молекулы и занимает его место, что приводит к «запиранию» гемопротеина в активной дезокси-конформации и экспрессии гена эритропоэтина, как и в условиях низкого напряжения кислорода в тканях. В пользу существования гем-содержащего сенсора свидетельствуют также данные по индукции гена эритропоэтина хелатирующим железо соединением десферриоксамином [48–50]. Недавно такая возможность была теоретически подтверждена ab initio исследованием, которое показало, что пространственной конформации дезоксиформы (FeР+H₂O) гема гемоглобина может соответствовать оксиформа (CoР+O2) кобальтогема [51]. Гем-содержащий белок – не единственный кандидат на роль «сенсора кислорода» [52] .

После того, как сигнал о понижении концентрации кислорода в окружающей клетки среде принят, в клетке начинается цепь событий, ключевым из которых является связывание так называемого индуцируемого гипоксией фактора 1 (Hypoxia-inducible Factor 1, HIF-1) c цис-действующим чувствительным к гипоксии элементом (Hypoxia-response element, HRE), являющимся частью энхансера гена эритропоэтина [53– 58]. HIF-1 принадлежит к семейству транскрипционных факторов BHLH ( basic-helix-loop-helix) и состоит из двух субъединиц HIF-1? и HIF-1? [48, 59]. К настоящему времени установлено, что в различных клетках HIF-1 вызывает экспрессию различных белков, т. е. адаптация клеток и организма в целом к гипоксии осуществляется универсальным путем – через активацию белков HIF, являющихся транскрипционными факторами для генов, кодирующих белки, стимулирующие не только продукцию новых эритроцитов (например, эритропоэтин), но и ангиогенез, т. е. образование новых кровеносных сосудов, а также гликолиз как способ получения энергии при недостатке или отсутствии кислорода [50, 52, 60–63]. В частности, показано, что посредством HIF-1 при гипоксии стимулируется экспрессия генов ряда ферментов гликолиза [64–67], регуляторов ангиогенеза и тонуса сосудов [68–70], трансферрина и его рецептора [71–73], белка, связывающегося с инсулиноподобным фактором роста [74] и некоторыми другими.

Подсчитано, что около 5% генома человека находится под контролем HIF-1 и что, кроме генов, контролирующих гликолиз и ангиогенез, мишенями HIF-1 являются также гены, регулирующие клеточный рост, деление, выживание и подвижность клеток [63].

Кобальт, уже почти два века известный своими эффектами на эритроидное кроветворение, как понятно теперь [43], реализует через HIF многие свои эффекты, в том числе и токсические, обусловленные концентрациями, лежащими в правой части кривой на рис. 2.

Для оценки токсического влияния на организм кобальта в высоких концентрациях нами было предпринято экспериментальное исследование ранних (в течение первых 6 ч после воздействия) физиологических эффектов хлорида кобальта при его введении в организм животного: проявлений токсичности, изменений уровня потребления кислорода, показателей дифференцировки и пролиферации клеток костного мозга в условиях in vivo. Рассмотрены были также изменения костномозгового кроветворения в культивируемом путем управляемой перфузии изолированном кроветворном органе (грудина собаки) и показатели пролиферации некроветворных клеток в культуре фибробластоподобных клеток. Схема исследований представлена на рис. 3

Материалы и методы

Эксперименты in vivo проводили на крысах Wistar массой 200 – 250 г, мышах ICR массой 18 – 22 г, которым подкожно вводили раствор СоСl2 в физиологическом растворе (0.9% р-р NaCl) в стандартной дозе 250 мкмоль/кг массы животного. Животным контрольных групп вводили подкожно физиологический раствор в том же объеме. Количество животных в каждой группе было не менее десяти. Всего в работе использовано 110 крыс и 250 мышей.

Эксперименты на органном уровне проводили на изолированном перфузируемом кроветворном органе беспородных собак. Всего в эксперименте использовано 11 собак.

Культуральные исследования проводили на клетках линий L-929 и L-41.

Мазки костного мозга окрашивали по Романовскому-Гимза и по Папенгейму, показатели периферической крови оценивали общепринятыми методами, подсчет ретикулоцитов осуществляли на мазках, окрашенных бриллианткрезиловым синим.

В мазках костного мозга подсчитывали количество эритроидных клеток трех степеней зрелости (проэритробласты, эритробласты и нормобласты или Е₁+Е₂, Е₃, Е₄+Е₅) на одну тысячу ядросодержащих клеток, а также количество митозов на одну тысячу способных к делению эритроидных клеток (М) (по трем препаратам костного мозга на одну точку).

Для определения содержания ретикулоцитов в крови подопытных животных подсчитывали их количество среди 4 тысяч эритроцитов в двух окрашенных мазках на одну точку.

Определение удельной объемной скорости потребления кислорода у крыс Wistar in vivo проводили с использованием специального метаболиметра, основанного на принципе известного аппарата Шатерникова.

Для исследования токсического действия вводимой соли кобальта мышам вводили хлорид кобальта в дозе 5 мкмоль на мышь (что соответствует &asymp 250 мкмоль/кг), после чего определяли длительность плавания животных на поверхности резервуара площадью 0.5 м² при температуре 20° С (характеристика общего состояния животных) и длительность удержания на вращающемся валу (характеристика нейродефицита).

Для перфузионных экспериментов использовали у собак под общим наркозом выделяли и подключали к установке для искусственного жизнеобеспечения изолированного органа «Гомеостат 2» грудную кость, содержащую красный костный мозг. Подготовка животного к эксперименту, уникальная перфузионная установка «Гомеостат» и техника операции и перфузии разработаны в Международном научном центре исследований экстремальных состояний организма при Президиуме КНЦ СО РАН [75].Операции проводили под общим внутривенным тиопентал-натриевым наркозом (&asymp 10 мг/кг) с применением миорелаксантов (листенон) и управляемого интубационного эндотрахеального дыхания.

Клетки линий L-929 (фибробласты мыши) и L-41 (клетки, полученные из лейкоцитов больного лейкемией) культивировали в смеси сред 199 и Игла (1:1), к которой были добавлены сыворотка крупного рогатого скота (10%) и антибиотики. Пролиферативную активность культуры оценивали по: средней плотности клеток (N) в поле зрения микроскопа диаметром 0.2 мм (в среднем 30 – 50 полей зрения на каждый срок исследования; митотическому индексу, выраженному числом митозов на одну тысячу клеток на фиксированных и окрашенных препаратах; числу живых и мертвых клеток (на 200 клеток), выявленному прижизненным окрашиванием 0.1 % раствором трипанового синего; содержанию в клетках белка, определяемому по методу Лоури.

Все экспериментальные данные подвергали статистической обработке с использованием t-критерия Стьюдента.

Для оценки гипотезы о возможном механизме универсального действия кобальта как имитатора гипоксии на субклеточном уровне исходя из гипотезы о том, что сенсорной молекулой, чувствительной и к недостатку кислорода, и к избытку кобальта, является гемопротеин, было предпринято исследование ab initio методом квантовой химии [48]. Исследовали атомную и электронную структуры комплексов металлопорфирин (МеР)-O₂ и МеР-Н₂О в присутствии имидазола (Im) в качестве второго лиганда и без него (имидазольная группа гистидина – это ближайшая к гему функциональная группа глобина). Определяли энергию и особенности химической связи, а также изменения пространственной конфигурации гема в условиях гипоксии и при замещении атома железа в геме на атом кобальта.

Результаты исследования

Данные по изменению показателей эритроидного кроветворения у крыс представлены на рисунке 4.

Рис.4. Изменения показателей эритроидного кроветворения у крыс Wistar после подкожной инъекции хлорида кобальта в дозе 250 мкмоль/кг массы животного.

Таким образом, уже в первые часы после введения хлористого кобальта животным налицо активация эритроидного кроветворения, выражающаяся в изменяющемся соотношении содержания эритроидных клеток разных степеней зрелости и монотонно усиливающейся митотической активности. Поэтому на мышах ICR было предпринято более подробное исследование: показатели кроветворения и периферической крови снимали каждые 0.5 ч в течение первых трех часов после введения хлорида кобальта.

На рисунке 5 представлены данные, свидетельствующие об активации красного ростка костного мозга в первые три часа после введения хлорида кобальта.

Рис. 5. Динамика содержания ретикулоцитов в периферической крови и митотическая активность клеток красного ростка костного мозга у мышей в различные сроки после воздействия хлоридом кобальта

Одним из предположений об изменениях, вызываемых хлоридом кобальта на уровне целого организма, является то, что его введение в избыточных количествах приводит к так называемой гистотоксической гипоксии, т.е. к снижению потребления кислорода тканями организма при нормальной его доставке к ним.

Снижение скорости потребления кислорода у крыс Wistar на уровне целого организма иллюстрирует рисунок 6.

Рис. 6. Изменения удельной объемной скорости потребления кислорода у крыс Wistar после инъекции хлорида кобальта в дозе 250 мкмоль/кг массы. Сроки измерения: 5 мин, 3 и 6 ч после инъекции. Скорость потребления кислорода измеряли в м³*кг^-1*с^-1* 10^-8.

Визуально у животных сразу же после введения хлористого кобальта наблюдались затрудненное дыхание, одышка, слабость. Быстрота ответной реакции позволяет предположить участие в ней нервной системы.

Для оценки степени токсического влияния введенного в организм хлорида кобальта было предпринято исследование на мышах: длительность плавания (тест на токсичность) и способность удерживаться на вращающемся валу (тест на нейротоксичность). Данные представлены на рисунке 7. Исходя из этих данных, состояние животных после введения хлорида кобальта можно оценить как состояние ослабленное и нейродефицитное.

Рис. 7. Изменения длительности плавания и длительности удержания на вращающемся валу (% от исходной величины) у мышей после инъекции хлорида кобальта

Подводя краткий итог экспериментам in vivo, можно констатировать, что происходящая в ранние сроки после введения в организм избыточного количества хлорида кобальта реакция со стороны кроветворения развивается на фоне тяжелого гипоксического состояния всего организма, интоксикации и нейродефицита.

Для того, чтобы исследовать происходящие под воздействием хлорида кобальта в красном костном мозге изменения вне влияния организма как целого, были проведены эксперименты на изолированном перфузируемом костном мозге собаки.

При перфузии без добавления хлорида кобальта общая концентрация клеток костного мозга в 1 мл после 6-часового эксперимента не превышала исходный уровень ((2.65±0.20)x10⁹) и была равна (2.60±0.33)x10⁹. Шестичасовая перфузия с добавлением хлорида кобальта вызывала значительное увеличение этого показателя до (4.35±0.33)x10⁹ . Результаты анализа препаратов костного мозга представлены в таблице 1.

Таблица 1

Изменения костномозгового эритроидного кроветворения после 6-часовой перфузии изолированной грудины собаки

Как свидетельствуют данные таблицы1, перфузия костного мозга без добавления хлорида кобальта мало изменяет показатели эритроидного кроветворения. Процентное содержание эритроидных клеток практически не изменяется, отмечается лишь незначительный сдвиг в сторону более зрелых элементов при статистически достоверном уменьшении содержания клеток самого молодого возраста Е₁+Е₂. При добавлении в перфузионную среду хлорида кобальта изменения по сравнению с исходными величинами хорошо выражены: достоверно снижено содержание клеток молодого и среднего возраста Е₁+Е₂ и Е₃, а содержание наиболее зрелых клеток Е₄+Е₅ значительно повышено. Митотический индекс эритроидных клеток более чем в 2 раза выше исходного (77.52±6.04 против 34.79±4.91 ‰ в исходной пробе). Процентное содержание эритроидных клеток также значительно увеличено (53.44±1.68 против исходного значения 29.70±2.00 %). Если рассмотреть различия между исследуемыми показателями в конце перфузии (т.е. именно между опытом и контролем), то можно видеть, что хотя содержание клеток разного возраста не имеет достоверных различий, все-таки, по средним величинам судя, есть тенденция к уменьшению содержания клеток более молодого возраста Е₁, Е₂ и Е₃ при повышении содержания клеток Е₄ и Е₅. При этом различия в митотической активности существенны. Содержание эритроидных клеток также достоверно выше.

Полученные в эксперименте по управляемой перфузии изолированного кроветворного органа результаты свидетельствуют об активации эритроидного кроветворения хлоридом кобальта в отсутствие регуляторных влияний со стороны целого организма по крайней мере за счет усиления пролиферативной активности красных клеток костного мозга.

Для оценки возможности хлорида кобальта влиять на пролиферативную активность клеток было предпринято исследование на клетках в культуре.

При добавлении хлорида кобальта в культуральную среду в на 7-е сутки культивирования в среде с 10 % сыворотки (стационарная фаза роста, состояние покоя) обнаружили усиление пролиферативной активности фибробластов.

Данные по влиянию добавления хлорида кобальта на пролиферацию клеток в культуре представлены на рисунках 8 и9.

Рис. 8. Изменения митотического индекса (Mi) и средней плотности в поле зрения микроскопа (Ni) клеток линии L-929 в состоянии покоя под влиянием хлорида кобальта в концентрации 10-6 М (добавление хлорида кобальта в питательную среду на 7-е сутки роста в среде с 10 % сыворотки).

Рис. 9. Изменения митотического индекса (А) и средней плотности в поле зрения микроскопа клеток линии L-41 под влиянием хлорида кобальта в концентрации 10-8 М (добавление хлорида кобальта в питательную среду на 7-е сутки роста).

Данные рисунков 8 и 9 позволяют предположить, что хлорид кобальта при введении в культуру клеток вызывает усиление клеточной пролиферации. Подтверждением этого явилось также возрастание содержания белка в лизате клеток культуры.

Все приведенные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что в клетках различной природы существует некий универсальный способ ответа на избыток кобальта. Поэтому предприняли расчетное исследование, основанное на одной из существующих гипотез о внутриклеточном механизме такого ответа [43, 44]. Суть гипотезы состоит в том, что атом кобальта при его избытке в клетке может вытеснять из молекул гемопротеинов атом железа, занимать его место – и это изменяет конформацию гема таким же образом, как ее изменяет низкое напряжение кислорода во внутриклеточной среде, т.е. гипоксия.

Оценить количественно соотношение концентраций всех веществ, реализующих этот гипотетический механизм, невозможно. Но можно исследовать природу химических связей в комплексах железо- и кобальтопорфиринов с лигандами, в качестве которых выступили: молекула O₂ , которая присоединяется как лиганд к гему в условиях нормоксии, молекула Н2О, присоединяющаяся к гему в отсутствие кислорода, т.е. при гипоксии (обе молекулы занимают 5-е координационное положение), и имидазольное кольцо аминокислоты гистидина (6-е координационное положение).

Энергию связей Ме-O₂ и Ме-Н2О (Есв.) рассчитывали по формуле:

Есв.=Е_МеР-O2 – Е_МеР – Е_O2 , где

Е_МеР-O2 – энергия комплекса МеР-O₂, Е_МеР – энергия комплекса МеР, Е_O2 – энергия кислорода. Все расчеты энергии связи (табл. 2) проведены для основных состояний молекул [48].

Таблица 2

Энергия связи металл – лиганд в комплексах МеР - лиганд)

Примечание: Ме-O₂ (Н₂О) – энергия связи комплекса металл (Fe или Co) – лиганд в 6-м положении, Im-Me-O2 (H₂O) – энергия связи в 6-м положении при наличии имидазола в 5-м.

Данные таблицы 2 свидетельствуют о том, что как для атома железа, так и для кобальта в комплексах МеР и МеРIm присоединение кислорода более выгодно, чем присоединение воды. Присутствие в моделируемых комплексах в качестве второго лиганда имидазола в 5-м координационном положении увеличивает энергию связи Ме-O₂ и Ме-Н2О для железа (в 2.5 и 1.8 раза соответственно) и уменьшает – для кобальта (в 1.6 и 1.4 раза соответственно).

Качественную оценку различия энергии связей (ΔЕ) в комплексах FeР и CoP осуществляли по формуле:ΔЕ= Е_FeP – E_CoP – E_Fe + E_Co

Расчет показал, что ΔЕ = -37.34 ккал/моль, т.е. атом кобальта связывается с порфириновым кольцом более прочно, чем атом железа.

Результаты сравнения геометрии комплексов представлены в таблице 3

Таблица 3

Смещение атома металла по отношению к порфириновому кольцу для различных

Как следует из табл. 3, атом кобальта, если он замещает железо в геме, при наличии в 6-м координационном положении имидазола (имитация ближнего глобинового окружения) и присоединении в 5-м координационном положении кислорода (это имитация обычного, нормоксического состояния клетки) ведет себя не так, как атом железа – атом железа и при молекуле воды (гипоксия), и при молекуле кислорода (нормоксия) в 5-м координационном положении смещается ближе к плоскости гема, атом кобальта, если присоединяется вода (гипоксия) также смещается ближе к порфириновому кольцу, а вот в ситуации, когда кислород есть, но в гем встроен не атом железа, а атом кобальта, этот атом смещается не в сторону имидазольной группы, как во всех остальных рассмотренных случаях, а в противоположную сторону – к присоединившейся молекуле кислорода. В результате оказывается, что атом кобальта в геме, находящемся в условиях нормального содержания кислорода, и атом железа в геме при гипоксии, находятся приблизительно на одинаковых расстояниях от плоскости порфиринового кольца, т.е. комплекс кобальта с кислородом (избыток кобальта при нормоксии) имитирует комплекс железа с водой (без кобальта, но в условиях гипоксии). Это обстоятельство подкрепляется способностью кобальта более прочно связываться с гемом, чем железо. Данные этого раздела предоставляют еще одно свидетельство тому, что избыток кобальта в организме может ощущаться его клетками как гипоксия.

Заключение

Подводя краткий итог изложенному, можно сделать следующие выводы.

В ответ на введение в организм избыточного количества хлорида кобальта происходит активация эритроидного кроветворения в первые же часы после воздействия. Наблюдаются как изменения содержания клеток эритропоэза различной степени зрелости, так и активация пролиферации эритроидных клеток. Содержание пролиферирующих клеток растет вплоть до 3 ч после воздействия. В периферическую кровь поступают новые порции ретикулоцитов.

Эта реакция красного костного мозга развивается на фоне тяжелого гипоксического состояния организма в целом, интоксикации и выраженного нейродефицита. В отсутствие влияния со стороны целого организма, в условиях управляемой перфузии изолированного кроветворного органа – костного мозга – в течение шести часов, также наблюдается активация эритроидного кроветворения, выражающаяся в усилении митотической активности костномозговых эритроидных клеток. О том, что происходит именно активация, а не накопление клеток в митозе, вызванное самой перфузией, свидетельствует тот факт, что повышения митотической активности эритроидных элементов не наблюдалось при контрольных перфузиях без кобальта, а также то, что при перфузии жидкостью, содержащей кобальт, в отличие от перфузии без кобальта, значимо увеличивалось процентное содержание в изолированном костном мозге эритроидных клеток при увеличении почти вдвое общего содержания клеток всех видов.

О возможности непосредственной стимуляции пролиферации клеток хлоридом кобальта путем выведения их из состояния пролиферативного покоя свидетельствуют эксперименты, проведенные на культуре фибробластоподобных клеток.

Проведенные расчеты химических связей и геометрии комплексов кобальта и железа с порфиринами в условиях нормального и недостаточного содержания кислорода позволяют предположить существование универсальной внутриклеточной реакции на избыточное поступление кобальта.

Следует отметить, что многочисленные исследования, обнаруженные в доступной нам литературе и касающиеся биологического действия кобальта, можно разделить на две большие группы: авторы одной из них рассматривают кобальт в экологическом аспекте как вредный в избытке природный агент и промышленный токсикант, вообще не уделяя никакого внимания положительным его эффектам на организм, авторы другой группы работ рассматривают кобальт в физиологическом аспекте и сосредоточены на его эритропоэтической функции, вообще на опосредованном эритропоэтином влиянии на кроветворение, а в последнее время – на универсальной его роли в активации HIF, оставляя вне внимания общетоксические проявления биологического действия элемента № 27. В нашей работе мы попытались объединить оба аспекта проблемы, рассматривая одновременно и кроветворное (причем, в первые 6 часов после воздействия, когда вырабатываемый в ответ на воздействие еще не может быть опосредован индуцированным этим воздействием эритропоэтином) и общетоксическое влияния хлорида кобальта на организм млекопитающих в первые часы после воздействия.

В конечном итоге, осмысливая полученные результаты и сопоставляя их с литературными данными, мы попытались обобщить представление о сложной ответной реакции организма на острое воздействие такого экологически значимого химического фактора, как повышенное содержание кобальта и его солей в окружающей среде, в виде схемы, представленной на рисунке 10.

Рис. 10. Схематическое представление о сложной многостадийной реакции, возникающей в организме животного в ответ на избыточное поступление хлорида кобальта.

Подобная многостадийная реакция может быть (со своими физиологическими и метаболическими особенностями, разумеется) характерна для избыточного поступления в организм млекопитающих не только кобальта, но и других биологически значимых элементов. При этом на участке кривой физиологического эффекта (см. рис. 2) в диапазоне концентраций от С1 до С2 могут доминировать процессы, обеспечивающие физиологический гомеостаз, а при концентрациях выше С2 могут усиливаться и начать превалировать другие, отражающие токсическое действие данного агента.

Список литературы

1. Вернадский В.И. Биогеохимические очерки 1922 – 1932 гг. – М. – Л.: АН СССР, 1940. – 249 с.

2. Вернадский В.И. Очерки геохимии. – М.: Наука, 1983. – 422 с.

3. Underwood E.G. Trace Elements in Human and Animal Nutrition / 4rd Ed. – New York: Acad. Press, 1977. – 402 p.

4. Войнар А.И. Биологическая роль микроэлементов в организме животных и человека. – М.: Высшая школа, 1960. – 544 с.

5. Ковальский В.В. Геохимическая экология. Очерки. – М.: Наука, 1974. – 299 с.

6. Ковальский В.В. Геохимическая среда и жизнь. – М.: Наука, 1982. – 77 с.

7. Ковальский В.В. Современные направления и задачи биогеохимии // Биологическая роль микроэлементов. – М., 1983. – С. 3 – 17.

8. Авцын А.П. Микроэлементозы человека // Клин. мед. – 1987. – № 6. – С. 36.

9. Авцын А.П., Жаворонков А.А., Риш М.А.,Строчкова Л.С. Микроэлементозы человека. – М.: Медицина, 1991. – 496 с.

10. Гончаревская О.А., Монин Ю.Г., Наточин Ю.В. Регуляция скорости проксимальной и дистальной реабсорбции при внутриканальцевом введении кобальта // Физиол. журн. – LXXI, № 10. – С. 1287 – 1292.

11. Yamagami K., Nishimura S., Sorimachi M. Cd2+ and Co2+ at micromolar concentrations mobilize intracellular Ca2+ via the generation of inositol 1,4,5-triphosphate in bovine chromaffin cells // Brain Res. – 1998. – Vol.798. – P. 316 – 319.

12. Comhaire S., Blust R., Van Ginneken L., et al. Branchial cobalt uptake in the carp, Cyprinus carpio: Effect of calcium channel blockers and calcium injection // Fish Physiol. Biochem. – 1998. – Vol. 18. – P. 1 – 13.

13. Кудрин А.В. Металлы и протеолитические ферменты // Вопр. биол. мед. фарм. химии. – 1999. – № 3. – С. 19 – 24.

14. Nieboer E., Sanford W.E. Essential, toxic and therapeutic functions of metals (including determinant of reactivity) // Rev. Biochem. Toxicol. 7. – New York, 1985. – P. 205 – 245.

15. Young R.S. Cobalt // Biochem. essent. ultratrace elem. – 1985. – P. 133 – 147.

16. Taylor A., Marks V. Сobalt: a review // J. Hum. Nutr. – 1978. – Vol. 32. – P. 145 – 177.

17. Taylor A. Detection and monitoring of disorders of essential trace elements // Ann. Clin. Biochem. – 1996. – Vol. 33. – P. 486 – 510.

18. Ueno M., Seferynska J., Beckman B. et al. Enhanced erythropoietin secretion in hepatoblastoma cells in response to hypoxia // Am. J. Physiol. – 1989. – Vol. 257, No4. – P. C743 – C750.

19. Калиман П.А., Беловецкая И.В. Влияние хлорида кобальта на активность ключевых ферментов метаболизма гема в печени крысы // Биохимия. – 1986. – Т. 51, № 8. – С. 1307– 1308.

20. Shabaan A.A., Marks V. The role of pancreas in hyperlipaemic rats // Diabetologia. – 1975. – Vol. 11. – P. 376.

21. Taylor A. Therapeutic use of trace elements // Clin. Endocrinol. Metab. – 1985. – Vol. 14. – P. 703 – 724.

22. Зак В.И. О механизме зобогенного действия кобальта // Бюлл. Экпер. Биол. Мед. – 1968. – Т. 65, № 3. – С. 51 – 54.

23. Львова Г.Н., Чопикашвили Л.В., Васильева И.М. и др. Защитные действия аскорбиновой кислоты в клетках людей, контактирующих с хлоридом кобальта // Генетика. – 1990. – № 7. – С. 1316 – 1319.

24. Heath J.S., Daniel M.R. The production of malignant tumours by cobalt in the rat: Intrathoracic tumours // Brit. J. Cancer. – 1962. – Vol. 16. – P. 473.

25. Bertolero F., Sabbioni E., Edel J. et al. Quantitative studies on cytotoxicity and neoplastic transformation of BALB/3T3 cell by trace metals // Occupational and Environmental Chemical Hazard / Foa F. (Ed). – Chichester (UK): Ellis Horwood, 1987. – P. 478 – 483.

26. Chlorinated Drinking-water, Chlorinated By-products; Some Other Halogenated Compounds, Cobalt and Cobalt Compounds // World Health Organization – Internal Agency for Research on Cancer. IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans. – 1991. – Vol. 52. – P. 449 – 450.

27. Осинский С., Левитин И., Бубновская Л. и др. Селективность действия редокс-активных комплексов кобальта (III) на опухолевую ткань // Экспериментальная онкология – 2004. – Т. 26, № 2. – С. 18 – 24.

28. Nemery B., Lewis C.P.L.,Demedts M. Cobalt and possible oxidant-mediated toxicity // Sci. Total Environ. – 1994. – Vol. 150. – P. 57 – 64.

29. Edel J., Pozzi G., Sabbioni E. et al. Metabolic and toxicological studies on cobalt // Sci. Total Environ. – 1994. – Vol. 150. – P. 233 – 244.

30. McKinney J., Rogers R. Metal bioavailability // Environ. Sci. Technol. – 1992. – Vol. 26, No 7. – P. 1298 – 1299.

31. Ветров В.А., Кузнецова А.И. Микроэлементы в природных средах региона озера Байкал. – Новосибирск: Изд-во СО РАН НИЦ ОИГГМ, 1999. – 234 с.

32. Anderson S.P.T. Nickel and cobalt: Their physiological action on the animal organism // J. Anat. Physiol. – 1883. – Vol. 17. – P. 89 – 123.

33. Izom G.E., Way J.L. Cyanide intoxication: Protection with cobaltous chloride // Toxicol. Fppl. Pharmacol. – 1973. – Vol. 24. – P. 449 – 456.

34. Esclapez M., Trottier S. Changes in GABA-immunoreactive cell density during motor focal epilepsy induced by cobalt in the rat // Exp. Brain Res. 1989. – Vol. 76. – P. 369 – 385.

35. Вarceloux D.G. Cobalt // J Toxicol Clin Toxicol – 1999. – Vol. 37. – P. 201 – 206.

36.Chlorinated drinking-water; chlorination by-products; some other halogenated compounds; cobalt and cobalt compounds. International Agency for Research on Cancer (IARC) Working Group, Lyon, 12-19 June 1990. – 1991. – P. 1–544.

37. Goldoni M., Catalani S., De Palma G. et al. Exhaled breath condensate as a suitable matrix to assess lung dose and effects in workers exposed to cobalt and tungsten. Environ Health Perspect. – 2004. – Vol. 112. – P.1293–1298.

38. Palmes E.D., Nelson N., Laskin S., Kuschner M. Inhalation toxicity of cobalt hydrocarbonyl// Am Ind Hyg Assoc J. – 1959. – Vol. 20. – P. 453–468.

39. De Boeck M., Kirsch-Volders M., Lison D.. Cobalt and antimony: genotoxicity and carcinogenicity// Mutat Res. – 2003. – Vol. 533. – P. 135–152.

40. Lison D., De Boeck M., Verougstraete V., Kirsch-Volders M. Update on the genotoxicity and carcinogenicity of cobalt compounds// Occup Environ Med. – 2001. – Vol. 58. – P. 619–625.

41. Lison D., De Boeck M., Verougstraete V., Kirsch-Volders M. Update on the genotoxicity and carcinogenicity of cobalt compounds // Occup Environ Med. – 2001 – Vol.58. – P. 619–625.

42. Pulido M.D., Parrish A.R. Metal-induced apoptosis: mechanisms // Mutat Res. – 2003. – Vol. 533. – P. 227–241.

43. Bruick R.K. Oxygen sensing in the hypoxic response pathway: regulation of the hypoxia-inducible transcription factor // Genes Dev. – 2003. – Vol. 17. – P. 2614–2623.

44. Malard V., Berenguer F., Pratt O. et al. Global gene expression profiling in human lung cells exposed to cobalt // BMS Genomics. – 2007. – Vol. 8. – P. 147 – 164.

45. Goldberg M.A., Glass G.A., Cunningham J.M., Bunn H.F. The Regulated Expression of Erythropoietin by Two Human Hepatoma Cell Lines // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1987. – Vol. 84, No 22. – P. 7972 – 7976.

46. Goldberg M.A., Dunning S.P., Bunn H.F. Regulation of the Erythropoietin Gene: Evidence That the Oxygen Sensor Is a Heme Protein // Science. – 1988. – Vol. 242. – P. 1412 – 1415.

47. Goldberg M.A., Imagawa S., Dunning S.P., BunnH.F. Oxygen Sensing and Erythropoietin Gene Regulation // Contrib. Nephrol. – 1989. – Vol. 76. – P. 39 – 51.

48. Wang G.L., Jiang B.-H., Rue E.A., Semenza G.L. Hypoxia-inducible Factor 1 Is a Basic-Helix-Loop-Helix-PAS Heterodimer Regulated by Cellular O2 Tension // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1995. – Vol. 92. – P. 5510 – 5514.

49. Jiang B.-H., Zheng J.Z., Leung S.W. et al. Transactivation and Inhibitory Domains of Hypoxia-inducible Factor 1? // J. Biol. Chem. – 1997. – Vol.272, No 31. – P. 19253 – 19260.

50. Ratcliffe P.J., Maxwell P.H., Pugh C.W. Beyond Erythropoietin: The Oxygen Sensor // Nephrol. Dial. Transplant. – 1997. – Vol. 12. – P. 1842 – 1848.

51. Романова Т.А., Кравченко О.В., Моргулис И.И. и др. Подтверждение гипотезы гемопротеинового сенсора ab initio методом квантовой химии // Координационная химия. – 2004. – Т. 30, № 6. – с. 432 – 435.

52. Wenger R.H. Mammalian Oxygen Sensing, Signalling and Gene Regulation // J. Exp. Biol. – 2000. – Vol. 203. – P. 1253 – 1263.

53. Beck I., Weinmann R., Caro J. Characterization of Hypoxia-Responsive Enhancein the Human Erythropoietin Gene Shows Presence of Hypoxia-inducible 120-kD Nuclear DNA-Binding Protein in Erythropoietin-Producing and Nonproducing Cells // Blood. – 1991. – Vol. 82, No 3. – P. 704 – 711.

54. Beck I., Ramirez S., Weinmann R., Caro J. Enhancer Element at the 3?- Flanking Region Controls Transcriptional Response to Hypoxia in the Hyman Erythropoietin Gene // J. Biol. Chem. – 1991. – Vol.266, No 24. – P. 15563 – 15566.

55. Pugh C.W., Tan C.C., Jones R.W., Ratcliffe P.J. Functional Analysis of an Oxygen-Regulated Transcriptional Enhancer Lying 3? to the Mouse Erythropoietin Gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1991. – Vol. 88. – P. 10553 – 10557.

56. Maxwell P.H., Pugh C.W., Ratcliffe P.J. Inducible Operation of the Erythropoietin 3? Enhancer in Multiple Cell Lines: Evidencе for a Widespread Oxygen-Sensing Mechanism // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1993. – Vol. 90. – P. 2423 – 2427.

57. Semenza G.L., Nejfelt M.K., Chi S.M., Antonarakis S.E. Hypoxia-Inducible Nuclear Factors Bind to an Enhancer Element Located 3? to the Human Erythropoietin Gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1991. – Vol. 88. – P. 5680 – 5684.

58. Semenza G.L., Wang G.L. A Nuclear Factor Induced by Hypoxia via De Novo Protein Synthesis Binds to the Human Erythropoietin Gene Enhancer at a Site Required for Transcriptional Activation // Mol. Cell. Biol. – 1992. – Vol. 12, No 12. – P. 5447 – 5454.

59. Wang G.L., Semenza G.L. Purification and Characterization of Hypoxia-Inducible Factor 1 // J. Biol. Chem. – 1995. – Vol.270. – P. 1230 – 1237.

60. Semenza G.L. HIF-1: Mediator of Physiological and Pathophysiological Responses to Hypoxia // J. Appl. Physiol. – 2000. – Vol. 88. – P. 1474 – 1480.

61. Semenza G.L. HIF-1 and Human Disease: One Highly Involved Factor // Genes&Development. – 2000. – Vol. 14. – P. 1983 – 1991.

62. Bruick R.K., McKnight S.L. Oxygen Sensing Gets a Second Wind // Science. – 2002. – Vol. 295. – P. 807 – 808.

63. Marx J. How Cells Endure Low Oxygen // Science. – 2004. – Vol. 303. – P. 1454 – 1456.

64. Firth J.D., Ebert B.L., Pugh C.W., Ratcliffe P.J. Oxygen-regulated Control Elements in the Phosphoglycerate Kinase 1 and Lactate Dehydrogenase A Genes: Similarities with the Erythropoietin 3? Enhancer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1994. – Vol. 91. – P. 6496 – 6500.

65. Semenza G.L., Roth P.H., Fang H.-M., Wang G.L. Transcriptional Regulation of Genes Encoding Glycolytic Enzymes by Hypoxia-inducible Factor 1 // J. Biol. Chem. – 1994. – Vol. 269, No 38. – P. 23757 – 23763.

66. Firth J.D., Ebert B.L., Ratcliffe P.J. Hypoxic Regulation of Lactate Dehydrogenase A // J. Biol. Chem. – 1995. – Vol. 270. – P. 21021 – 21027.

67. Semenza G.L., Jiang B.-H., Leung S.W. et al. Hypoxia Response Elements in the Aldolase A, Enolase 1, and Lactate Dehydrogenase A. Gene Promoters Contain Essential Binding Sites for Hypoxia-inducible Factor 1 // J. Biol. Chem. – 1996. – Vol. 271, No 51. – P. 32529 – 32537.

68. Forsythe J.A., Jiang B.-H., Iyer N.V. et al. Activation of Vascular Endothelial Growth Factor Gene Transcription by Hypoxia-inducible Factor 1 // Mol. Cell. Biol. – 1996. – Vol. 16. – P. 4604 – 4613.

69. Melillo G., Musso T., Sica A. et al. A Hypoxia-responsive Element Mediates a Novel Pathway of Activation of the Inducible Nitric Oxide Synthase Promoter // J. Exp. Med. – 1995. – Vol. 182. – P. 1683 – 1693.

70. Palmer L.A., Semenza G.L., Stoler M.H. et al. Hypoxia Induces Type II NOS Gene Expression in Pulmonary Artery Endothelial Cells via HIF-1 // Am. J. Physiol. – 1998. – Vol. 274. – P. L212 – L219.

71. Rolfs A., Kvietikova I., ntification ofGassmann M., Wenger R.H. Oxygen-regulated Transferrin Expression Is Mediated By Hypoxia-inducible Factor-1 // J. Biol. Chem. – 1997. – Vol. 272. – P. 20055 – 20062.

72. Lok C.N., Ponka P. Ide a Hypoxia Response Element in the Transferrin Receptor Gene // J. Biol. Chem. – 1999. – Vol. 274. – P. 24147 – 24152.

73. Tacchini L., Bianchi L., Bernelli-Zazzera A., Cairo G. Transferrin Receptor Induction by Hypoxia. HIF-1-mediated Transcriptional Activation and Cell-Specific Post-transcriptional Regulation // J. Biol. Chem. – 1999. –Vol. 274. – P. 24142 – 24146.

74. Tazuke S.I., Mazure N.M., Sugawara J. et al. Hypoxia Stimulates Insulin-like Growth Factor Binding Protein 1 (IGFBP-1) Gene Expression in HepG2 Cells: a Possible Model for IGFBP-1 Expression in Fetal Hypoxia // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1998. – Vol. 95. – P. 10188 – 10193.

75. Нефедов В.П., Самойлов В.А., Гареев Р.А. и др. Управление функциональной активностью органов при перфузии. – Новосибирск: Наука, 1981. – 204 с.